論文 - 岩田 尚孝
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Effects of a gel culture system made of polysaccharides (xanthan gum and locust bean gum) on in vitro bovine oocyte development and gene expression of the granulosa cells. 査読あり
Sugimoto A, Inoue Y, Tanaka K, Sinozawa A, Shirasuna K, Iwata H
Molecular Reproduction and Development 88 ( 7 ) 516 - 524 2021年07月
担当区分：責任著者 記述言語：英語 掲載種別：研究論文（学術雑誌）
DOI： 10.1002/mrd.23518.
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Resveratrol enhanced mitochondrial recovery from cryopreservation-induced damages in oocytes and embryos 招待あり 査読あり
Hisataka Iwata
Reprod Med Biol 20 ( 4 ) 419 - 426 2021年06月
担当区分：筆頭著者 記述言語：英語 掲載種別：研究論文（学術雑誌）
DOI： 10.1002/rmb2.12401.
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Effect of maternal aging and vitrification on mitochondrial DNA copy number in embryos and spent culture medium. 査読あり
Aoki S, Ito J, Hara S, Shirasuna K, Iwata H.
Reproductive Biology 21 ( 2 ) 100506 2021年06月
担当区分：責任著者 記述言語：英語 掲載種別：研究論文（学術雑誌）
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Mitochondrial reactive oxygen species regulate mitochondrial biogenesis in porcine embryos 査読あり
Kageyama M, Ito J, Shirasuna K, Kuwayama T, Iwata H
Journal of Reproduction and Development 67 ( 2 ) 141 - 147 2021年04月
担当区分：責任著者 記述言語：英語 掲載種別：研究論文（学術雑誌）
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凍結に由来するミトコンドリア障害からの胚の回復 招待あり 査読あり
伊藤 洵、 岩田 尚孝
Journal of mammalian Ova Research 38 ( 1 ) 25 - 29 2021年04月
担当区分：筆頭著者 記述言語：日本語 掲載種別：研究論文（学術雑誌）
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多糖類で作成した基質が，ウシ初期胞状卵胞卵子の体外発育に及ぼす影響
杉本 彩嘉, 井上 裕貴, 田中 啓介, 岩田 尚孝
日本繁殖生物学会 講演要旨集 114 ( 0 ) OR-5 - OR-5 2021年
記述言語：日本語 出版者・発行元：公益社団法人 日本繁殖生物学会
<p>【目的】生体内と生体外における卵子の発育環境の違いの一つに，基質の硬さが挙げられる。過去に我々は，ポリアクリルアミドゲルや食品等に用いられる増粘多糖類を用いた柔軟な基質がブタ顆粒層細胞（GCs）の増殖を増強し，卵母細胞の発育能力を改善したことを報告している。本研究では，この基質がウシ初期胞状卵胞由来卵子の体外発育に及ぼす影響とその分子背景を遺伝子発現解析にて検討した。【方法】卵子顆粒層細胞複合体（OGCs）は初期胞状卵胞（EAF，直径400–700 µm）から回収した。キサンタンガム（1%）およびローカストビーンガム（1%）（株・三晶より提供）を等量混合してゲルを作成した。OGCsは個別で従来のプラスチックプレート（プレート区）およびゲル上（ゲル区）で16日間体外発育し，GCsおよび発育卵子を比較した。卵子のミトコンドリア（Mt）膜タンパク質量（TOMM20）は免疫染色で，脂質量はBODIPY染色で比較した。また体内発育の対象区として胞状卵胞（AF，直径3–6 mm）とEAFから採取した卵子を用いた。さらに体外発育後16日目のOGCsからGCsを採取しRNAseqに供した。【結果】ゲル区とプレート区間では，GCsの数および生存率はゲル区で有意に高かった（P<0.01）。卵子直径はゲル区で有意に大きかった（P<0.01）。体外成熟率には差が認められなかったが（33.3 vs 28.9%），正常受精率はゲル区で有意に高かった（P<0.01）。さらに卵子のMt量は，AF卵子，ゲル区，プレート区，EAF卵子の順で高い値を示し，脂質含量は，ゲル区，AF卵子，プレート区，EAF卵子の順になった。RNAseqによる変動遺伝子をGO解析すると，Focal adhesionやActin cytoskeleton，Hippo-singlingに関連する増殖経路がゲル区で活性化している事が示された。本研究から，増粘多糖類基質は卵子の体外発育を支持し，その背景であるGCsの性状変化を示すことができた。</p>
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増粘多糖類で作成したゲル基質を体外成熟に用いるとウシ胚発生が有意に改善する
原 駿介, 井上 裕貴, 田中 啓介, 野口 龍生, 白砂 孔明, 岩田 尚孝
日本繁殖生物学会 講演要旨集 114 ( 0 ) OR-6 - OR-6 2021年
記述言語：日本語 出版者・発行元：公益社団法人 日本繁殖生物学会
<p>【目的】体外成熟を行った卵子は体内成熟した卵子に比べて発生能力が劣る。体内と体外の培養条件の差の一つに基質の堅さが考えられる。本研究では，植物由来の増粘多糖類で作成したゲル基用いて卵子を体外成熟させ，胚発育能力や顆粒層細胞と卵子の遺伝子発現を検討した。【方法】PBSに合計1%のXhanthangumとLocustbeangum（三晶より提供）を加え，撹拌・加熱溶解した。その後96ウェルプレートに滴下（80 μl/ウェル）・冷却し，ゲルを作成した。ゲルはovernightし，使用前に，培地を交換して用いた。実験では，卵巣から吸引採取した卵子を，プレート上（プレート区）とゲル上（ゲル区）で培養した。その後，体外授精を行い，胚盤胞期胚まで培養して，成熟率，受精率及び発生率を比較した。胚盤胞期胚は，細胞数を比較した。また，体外成熟後の卵子のミトコンドリアDNAコピー数（RT-PCR），ATP含量を比較した。また，卵子中の脂肪含量とFアクチン量は蛍光顕微鏡下で比較した。さらに，成熟前卵子，ゲル区とプレート区の成熟後の卵子及びそれらの顆粒層細胞からRNAを抽出しRNAseqに供した。【結果】卵子の成熟率はゲル区とプレート区間で有意差はなく，正常受精率，発生率及び細胞数はゲル区で有意に高かった（P<0.05）。成熟後の卵子のATP含量とミトコンドリアDNAコピー数は差が無かったが，脂質量やFアクチン量はゲル区で有意に高かった（P<0.05）。成熟卵子の顆粒層細胞において，ゲル区で増える遺伝子はステロイド合成や脂質代謝経路に関連づけられ，ゲル区で減る遺伝子はFocal adhesionやMAPK signalingに関連付けられた。成熟卵子において，ゲル区で増える遺伝子は酸化的リン酸化やプロテアソーム，減る遺伝子はUbiquitin mediated proteolysisやRas signaling 経路などに関連付けられた。本研究では，ゲル基質を成熟培養に用いることで卵子の発生能力改善に役立つことが示された。</p>
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加齢で変動するウシ卵胞液中のmiRNAとそれらの卵子発育に及ぼす影響
永田 修大, 山口 仁希, 井上 裕貴, 田中 啓介, 白砂 孔明, 岩田 尚孝
日本繁殖生物学会 講演要旨集 114 ( 0 ) OR-3 - OR-3 2021年
記述言語：日本語 出版者・発行元：公益社団法人 日本繁殖生物学会
<p>【緒言】卵胞液（FF）は卵子発育の唯一の環境であり加齢によってその性状は変化する。FF中のmiRNAが卵子発育に重要な役割を果たしている事が示されており，本研究ではFF中のmiRNA頻度に加齢が及ぼす影響と，その変動miRNAが卵子体外発育に及ぼす影響を調べた。【方法】食肉センター由来から採取した若齢（25–50カ月）黒毛和種卵巣の初期胞状卵胞（直径0.5–0.7 mm）から卵子顆粒層細胞複合体（OGCs）を回収し16日間培養した。このOGCsから顆粒層細胞（GCs）と培養液を集めた。また若齢と加齢（140ヶ月以上）ウシ各5頭の卵胞（直径3–6 mm）からFFを回収した。FFと培養液はフィルター（0.2 μｍ）処理後SeraMirで集め，GCsからはNucleoSpin（Takara）でmiRNAを集めsmall-RNAseqに供した。mimic導入の検証は，ターゲット配列を有したpmirGLOvector（Promega）とmimic導入GCsのRNA-seqで行った。miRNAの導入はLipofectamine2000を用いた。【結果および考察】FF中に高濃度で存在するmiRNAのほとんどは，GCsやGCの培養液中に確認できた。FF中ではmiR10b，miR423，miR1246やmiR19b等に月齢間で有意な差が認められた。若齢FFに多いmiR19bを添加に用いた。GCsにmimicを添加するとベクターのターゲット配列に作用することが確認された。さらに添加後の変動遺伝子（RNAseq）ではmiR19bが上流因子として推測され，変動遺伝子に関連付けられるPathwaysはmiR19bのターゲット遺伝子群（Targetscan）と重複していた。mimic添加は，体外発育卵子の直径を有意に増加させ，H4K12アセチル化レベルを上昇させた。また成熟後の核成熟率は高い傾向にあった。本研究ではmiR19bは卵子の発育を支持するが加齢によって卵胞液に占める頻度が減ることが示された。</p>
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ウシ卵管液中のmiRNAが胚発育に及ぼす影響
青木 漱吾, 井上 裕貴, 石田 大樹, 田中 啓介, 野口 龍生, 白砂 孔明, 岩田 尚孝
日本繁殖生物学会 講演要旨集 114 ( 0 ) AW-7 - AW-7 2021年
記述言語：日本語 出版者・発行元：公益社団法人 日本繁殖生物学会
<p>【目的】体外で発育した胚（体外胚）は家畜やヒトの胚移植に広く用いられる。一方で体外胚の質は体内で発育した胚（体内胚）に比べて劣る。この差は卵管環境にあると推測されるが胚発育を左右する卵管内の因子は明らかではない。ウシの体内胚と体外胚の変動遺伝子（Noguchi <i>et al.</i>, 2019）から体内胚の上流因子として多くのmiRNAが推測された。そこで本研究では卵管液中に存在するmiRNAが胚発生を支持するのかを検討した。【方法】食肉センターより黒毛和種（4頭分）の排卵跡が確認できた卵巣側卵管から卵管液と卵管上皮細胞（OEC）を採取した。卵管液は0.2 μｍのフィルター処理後細胞外小胞中RNAを集めsmall RNA-seqに供した。OECは一日培養後に培地を逆転写PCRに供した。体外胚は卵巣卵子から定法で作成した。8細胞期胚を選び，透明帯除去後miRNA mimicとLipofectamine（Invitrogen）と共培養した。miRNA mimicの導入検証はウシ顆粒層細胞に導入したpmirGLOベクター（Promega）を用いて確認し，その効果は導入胚のRNA-seqとターゲット遺伝子（TXNIP）の免疫染色による蛋白発現解析で確認した。【結果】体内胚における上流因子miRNAは，卵管液のsmall RNA-seqで確認されたmiRNAと重複し，OECの培地中にも検出された。これらのmiRNAからmiR-17-5pを選びmimicとして添加した。この mimicはベクターのターゲット配列に特異的に作用し導入が確認された。またmimic添加後2日目の胚のRNA-seqからmiR-17-5pが作用していることが確認された。またターゲット遺伝子（TXNIP）の胚中蛋白発現量は有意に低下した。さらにmimic添加により胚盤胞までの発生率が有意に増加した。本研究により卵管液中のmiRNA（miR-17-5p）は胚発生に重要な役割を果たしていることが示された。</p>
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RNA-seqを用いた卵子・胚・顆粒層細胞において加齢によって変動するミトコンドリア関連遺伝子の探索
井上 裕貴, 田中 啓介, 岩田 尚孝
日本繁殖生物学会 講演要旨集 114 ( 0 ) P-6 - P-6 2021年
記述言語：日本語 出版者・発行元：公益社団法人 日本繁殖生物学会
<p>【目的】老化によるMt機能不全は卵子や胚の低質化の主要因であるが，そのメカニズムは不明である。Mtを構成する大抵の遺伝子は核DNAに移行しており，核ゲノムの遺伝子発現に起因することから，老化による核ゲノムの遺伝子発現変動はMt機能やMt合成に多大な影響を与えると考えられる。そこで本研究では，老化に伴う生殖細胞の遺伝子発現変動に着目し，我々が過去に行なった若齢-加齢間の卵子・胚および顆粒層細胞（GCs）の5種のRNA-seqデータを利用することで，発現変動遺伝子に内包されるMtに関連する遺伝子群の抽出と機能ごとの分類を行い，老化を背景としたMt関連遺伝子の遺伝子発現変動が卵子発育と胚発生におけるMt機能やMt合成に与える影響を調査した。【方法】RNA-seqは過去に行なった若齢-加齢牛に由来する5種の生殖細胞（GV期・M2期卵子，8細胞期胚，EAF由来・単培養GCs）の公開データを利用しCLC genomics workbench（QIAGEN）プラットホームを用いて解析することで，若齢-加齢間の発現変動遺伝子を同定した。Mtに関連する核およびMt関連遺伝子はMITOCARTA3.0（BROAD Institute）データベースを用いて抽出し，データベース上で注釈されたMt機能ごとに分類した。これらのデータを統合し，各RNA-seqによる若齢-加齢間の発現変動遺伝子とMt由来遺伝子を合致させることで，Mt機能ごとの遺伝子発現の変動を予測した。【結果】GCs，8細胞期胚は，主にMt膜活性・電子伝達系に関する核およびMt DNA由来のMt関連遺伝子の高発現が見受けられた。一方で，卵子ではMt機能全体にわたって加齢区においてMt関連遺伝子の発現増加が見受けられた。</p>
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Mitochondrial reactive oxygen species regulate mitochondrial biogenesis in porcine embryos 国際誌
KAGEYAMA Mio, ITO Jun, SHIRASUNA Koumei, KUWAYAMA Takehito, IWATA Hisataka
Journal of Reproduction and Development 67 ( 2 ) 141 - 147 2021年
記述言語：英語 掲載種別：研究論文（学術雑誌） 出版者・発行元：The Society for Reproduction and Development
<p> The number of mitochondria in blastocysts is a potential marker of embryo quality. However, the molecular mechanisms governing the mitochondrial number in embryos are unclear. This study was conducted to investigate the effect of reduced mitochondrial reactive oxygen species (ROS) levels on mitochondrial biogenesis in porcine embryos. Oocytes were collected from gilt ovaries and activated to generate over 4 cell-stage embryos at day 2 after activation. These embryos were cultured in media containing either 0.1 μM MitoTEMPOL (MitoT), 0.5 μM Mitoquinol (MitoQ), or vehicle (ethanol) for 5 days to determine the rate of development to the blastocyst stage. The mitochondrial number in blastocysts was evaluated by real-time polymerase chain reaction (PCR). Five days after activation, the embryos (early morula stage) were subjected to immunostaining to determine the expression levels of NRF2 in the nucleus. In addition, the expression levels of <i>PGC1α</i> and <i>TFAM</i> in the embryos were examined by reverse transcription PCR. One day of incubation with the antioxidants reduced the ROS content in the embryos but did not affect the rate of development to the blastocyst stage. Blastocysts developed in medium containing MitoT had lower mitochondrial DNA copy numbers and ATP content, whereas MitoQ showed similar but insignificantly trends. Treatment of embryos with either MitoT or MitoQ decreased the expression levels of NRF2 in the nucleus and levels of <i>PGC1α</i> and <i>TFAM</i>. These findings indicate that reductions in mitochondrial ROS levels are associated with low mitochondrial biogenesis in embryos.</p>
DOI： 10.1262/jrd.2020-111
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HIRATA Yoshiki, KATSUKURA Yusuke, HENMI Yuka, OZAWA Ren, SHIMAZAKI Sayaka, KUROSAWA Akira, TORII Yasushi, TAKAHASHI Hironori, IWATA Hisataka, KUWAYAMA Takehito, SHIRASUNA Koumei
Journal of Reproduction and Development 67 ( 4 ) 257 - 264 2021年
記述言語：英語 出版者・発行元：The Society for Reproduction and Development
<p> Advanced maternal age is a risk factor for female infertility, and placental dysfunction is considered one of the causes of pregnancy complications. We investigated the effects of advanced maternal aging on pregnancy outcomes and placental senescence. Female pregnant mice were separated into three groups: young (3 months old), middle (8–9 months old), and aged (11–13 months old). Although the body weights of young and middle dams gradually increased during pregnancy, the body weight of aged dams only increased slightly. The placental weight and resorption rate were significantly higher, and live fetal weights were reduced in a maternal age-dependent manner. Although mRNA expression of senescence regulatory factors (p16 and p21) increased in the spleen of aged dams, mRNA expression of p16 did not change and that of p21 was reduced in the placenta of aged dams. Using a cytokine array of proteins extracted from placental tissues, the expression of various types of senescence-associated secretory phenotype (SASP) factors was decreased in aged dams compared with young and middle dams. The aged maternal placenta showed reduced immune cell accumulation compared with the young placenta. Our present results suggest that models using pregnant mice older than 8 months are more suitable for verifying older human pregnancies. These findings suggest that general cellular senescence programs may not be included in the placenta and that placental functions, including SASP production and immune cell accumulation, gradually decrease in a maternal age-dependent manner, resulting in a higher rate of pregnancy complications.</p>
DOI： 10.1262/jrd.2021-034
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Comparative analysis of cell-free DNA content in culture medium and mitochondrial DNA copy number in porcine parthenogenetically activated embryos. 査読あり
Kobayashi M, Ito J, Shirasuna K, Kuwayama T, Iwata H.
Journal of Reproduction and Development 66 ( 6 ) 539 - 546 2020年12月
担当区分：責任著者 記述言語：英語 掲載種別：研究論文（学術雑誌）
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ウシの分娩前後における血漿中ミトコンドリア由来細胞外DNA量の変化と血液成分値との関係 査読あり
野口 龍生, 相澤 拓朗, 岩田 尚孝
日本畜産学会報 91 ( 3 ) 227 - 232 2020年10月
担当区分：責任著者 記述言語：英語 掲載種別：研究論文（学術雑誌）
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Prediction of major microRNAs in follicular fluid regulating porcine oocyte development 査読あり
Yuki Inoue, Yasuhisa Munakata, Akihisa Shinozawa, Ryoka Kawahara-Miki, Koumei Shirasuna, Hisataka Iwata
Journal of Assisted Reproduction and Genetics 37 ( 10 ) 2569 - 2579 2020年10月
担当区分：責任著者 記述言語：英語 掲載種別：研究論文（学術雑誌）
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Xanthan gum and locust bean gum substrate improves bovine embryo developmen 査読あり
Hara S, Aoki S, Nagata M, Shirasuna K, Noguchi T, Iwata H.
Reproduction in Domestic Animals. 55 ( 9 ) 1124 - 1131 2020年09月
担当区分：責任著者 記述言語：英語 掲載種別：研究論文（学術雑誌）
DOI： 10.1111/rda.13750.
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ウシの分娩前後における血漿中ミトコンドリア由来細胞外DNA量の変化と血液成分値との関係
野口 龍生, 相澤 拓朗, 岩田 尚孝
日本畜産学会報 91 ( 3 ) 227 - 232 2020年08月
記述言語：日本語 出版者・発行元：公益社団法人 日本畜産学会
<p>血液中には細胞外DNAが含まれる．ミトコンドリアに由来する細胞外DNAはその量が多く測定が容易である．本研究では血液中のミトコンドリア由来細胞外DNAがウシの生理状態によって変動するのかどうかを調べるため，ホルスタイン種の栄養状態が大きく変化する時期である分娩前後の血漿の成分値（遊離脂肪酸（NEFA），トリグリセリド（TG），乳酸脱水素酵素（LDH），およびグルコース）と細胞外DNA量との関係性について検討した．また，黒毛和種およびホルスタイン種を用いて人工授精後の妊娠の可否と授精時の細胞外DNA量との関係を検討した．血漿中のNEFA，TG ，LDH，グルコースおよび細胞外DNA量は，分娩前後で大きく変動した．細胞外DNA量とそれぞれの血漿成分の平均値間で相関を調べると，LDHと正の相関が，TGと負の相関があった．一方で合計14頭の人工授精時細胞外DNA量の結果では，受胎牛と不受胎牛間に有意な関係が認められなかった．</p>
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Abundance of cell-free mitochondrial DNA in spent culture medium associated with morphokinetics and blastocyst collapse of expanded blastocysts. 査読あり
Kobayashi M, Kobayashi J, Shirasuna K, Iwata H
Reproductive Medicine and Biology 19 ( 4 ) 404 - 414 2020年08月
担当区分：責任著者 記述言語：英語 掲載種別：研究論文（学術雑誌）
DOI： 10.1002/rmb2.12344
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Comparison of Gene Expression and Mitochondria Number Between Bovine Blastocysts Obtained in Vitro and in Vivo 査読あり
Tatsuo Noguchi, Takuro Aizawa, Yasuhisa Munakata, Hisataka Iwata
Journal of Reproduction and Development 66 ( 1 ) 35 - 39 2020年02月
担当区分：責任著者 記述言語：英語 掲載種別：研究論文（学術雑誌）
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Resveratrol treatment increases mitochondrial biogenesis and improves viability of porcine germinal-vesicle stage vitrified-warmed oocytes 査読あり
Ito J, Shirasuna K, Kuwayama T, Iwata H.
Cryobiology 93 37 - 43 2020年
担当区分：責任著者 記述言語：英語 掲載種別：研究論文（学術雑誌）